中華人民共和國進出口商品檢驗行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 中華人民共和國進出口商品檢驗行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)

　　　　 出口禽肉中桿菌肽殘留量檢驗方法
　　　　　　　　　 杯 碟 法 SN 0295?93
Method for the determination of bacitracin
residues in poultry meat for export
?Cylinder-plate method
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1　主題內(nèi)容與適用范圍
　　本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了出口禽肉中桿菌肽殘留量的抽樣、制樣和杯碟測定法。
　　本標(biāo)準(zhǔn)適用于出口凍雞中桿菌肽殘留量的檢驗。
2　引用標(biāo)準(zhǔn)
　　SN 0179　出口食品中四環(huán)素族抗生素殘留量檢驗方法
3　抽樣和制樣
3.1　檢驗批
　　以不超過2500件商品為一檢驗批。
　　同一檢驗批的商品應(yīng)具有相同特征,如包裝、標(biāo)記、產(chǎn)地、規(guī)格和等級等。
3.2　抽樣數(shù)量
　　　　　　　批量,件　　　　　　　　　　　　zui低抽樣數(shù),件
　　　　　　　　1～25　　　　　　　　　　　　　　　1
　　　　　　　26～100　　　　　　　　　　　 　　　5
　　　　　　　101～250 　　　　　　　　　　　　 10
　　　　　　　251～500 　　　　　　　　　　　　 15
　　　　　　　501～1000 　　　　　　　　　　　　 17
　　　　　 1001～2500　　　　 　　　　　　　　　20
3.3　抽樣方法
　　按3.2規(guī)定的抽樣件數(shù)隨機抽取,逐件開啟,每件至少取一袋作為原始樣品,原始樣
品總量不少于2kg,放入清潔容器內(nèi),加封后,標(biāo)明標(biāo)記,及時送交實驗室。
3.4　樣品制備
　　從每袋原始樣品中取出部分有代表性樣品,將可食部分放入絞碎機中絞碎均勻,充分
混勻、用四分法縮分不少于1kg試樣,裝入清潔容器內(nèi),加封后,標(biāo)明標(biāo)記。
3.5　樣品保存
　　將試樣于?18℃冷凍保存。
　　注：在抽樣及制樣過程中,必須防止樣品受到污染或發(fā)生殘留物含量的變化。
4　測定方法
4.1　方法提要
　　用33％吡啶溶液提取試樣中桿菌肽,將提取液再用甲醇提取,經(jīng)減壓濃縮至干,用磷
酸鹽緩沖液溶解殘留物,調(diào)整pH后用杯碟法測定。
4.2　設(shè)備和材料
4.2.1　培養(yǎng)皿：內(nèi)徑90mm,底部平整光滑的玻璃皿或塑料皿,并應(yīng)配有陶瓦蓋。
4.2.2　牛津杯：外徑7.8±0.1mm,內(nèi)徑6.0±0.1mm,高10±0.1mm,不銹鋼管。
4.2.3　游標(biāo)卡尺：測量范圍0～200mm,精度0.02mm,或使用抑菌圈測量儀測量。
4.2.4　離心機：轉(zhuǎn)速3000r/min。
4.2.5　旋轉(zhuǎn)式真空濃縮器。
4.2.6　恒溫培養(yǎng)箱：36±1℃。
4.2.7　高壓滅菌器。
4.2.8　其他：玻璃板,吸管,滴管,茄形瓶等。
4.3　試劑和培養(yǎng)基
4.3.1　試劑
4.3.1.1　吡啶: 分析純。
4.3.1.2　吡啶溶液：33％。取吡啶33mL,用蒸餾水定容至100mL。
4.3.1.3　甲醇：分析純。
4.3.1.4　磷酸鹽緩沖液:5％, pH6.5。稱取22.15g無水磷酸氫二鉀和27.85g無水磷酸
二氫鉀溶解于蒸餾水中,定容至1000mL。
4.3.1.5　氫氧化鈉溶液：1mol/L。
4.3.1.6　磷酸鹽緩沖液:1％, pH6.0。稱取2.0g無水磷酸氫二鉀和8.0g無水磷酸二氫
鉀溶解于蒸餾水中,定容至1000 mL。
4.3.1.7　桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)品：58 IU/mg(衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所提供)。
4.3.1.8　試驗菌種:藤黃微球菌(Micrococcus Luteus), 菌種號28008(衛(wèi)生部藥品生
物制品檢定所提供)。
4.3.2　培養(yǎng)基
4.3.2.1　增菌用培養(yǎng)基: 見附錄A第A1章。
4.3.2.2　基層用培養(yǎng)基: 見附錄A第A2章。
4.3.2.3　菌種層用培養(yǎng)基: 見附錄A第A3章。
4.4　測定步驟
4.4.1 工作液制備
4.4.1.1　桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)貯備液
　　準(zhǔn)確稱取適量的桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)品,用1％pH6.0磷酸鹽緩沖液配制成100 IU/mL的標(biāo)準(zhǔn)
貯備液,于冰箱中保存,可使用一周。
4.4.1.2　桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)工作液
　　吸取一定量桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)貯備液,用1％pH6.0磷酸鹽緩沖液稀釋成0.15和0.6 IU/mL
的工作標(biāo)準(zhǔn)液,以及0.025,0.050,0.100,0.200,0.400,0.800 IU/mL的稀釋液,作為制
備標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液,0.100 IU/mL的稀釋液為參考濃度溶液。以上稀釋液均須
當(dāng)日配制。
4.4.1.3　菌種培養(yǎng)及菌液的制備
　　將試驗菌種安瓿瓶上部消毒后敲碎,加入少量增菌用培養(yǎng)基(4.3.2.1)溶解后,移入
以上培養(yǎng)基中,混勻后于36±1℃培養(yǎng)24h,再轉(zhuǎn)接至瓊脂試管斜面(4.3.2.3), 培養(yǎng)16～
18h,然后加入適量生理鹽水,將菌苔洗下,備用。
4.4.2　試液制備:準(zhǔn)確稱取經(jīng)絞碎混勻的試樣10.0g于均質(zhì)器內(nèi),加入17mL吡啶溶液(33%),
均質(zhì)3min后,移入離心管中離心20 min(3000 r/min)。取上清液10mL,置于另一個離心管
內(nèi),加入30 mL甲醇充分振搖2min,再離心 20min(3000 r/min)。將上清液移入茄形瓶中,
減壓濃縮至干,加入3mL磷酸鹽緩沖液(5％)溶解即為樣液。此樣液中相當(dāng)于禽肉試樣濃度
為1.96g/mL。
4.4.3　測定
4.4.3.1　平板制備
　　于無菌平皿中加入 20mL熔化的基層用培養(yǎng)基(4.3.2.2),保持水平,待其凝固備用。
然后,將錐形瓶中菌種層用培基(4.3.2.3)經(jīng)熔化并冷卻至50～55℃,加入適量的試驗菌
液(4.4.1.3)使之充分混合后,取4mL注入上述基層培養(yǎng)基上,保持水平,待其凝固。在測
定前應(yīng)先用0.15 IU/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液對該菌液濃度的平板進行預(yù)測試,經(jīng)培養(yǎng)后其標(biāo)準(zhǔn)工作
液所呈現(xiàn)的抑菌圈直徑在10mm以上,則該菌液濃度的平板即可使用,否則須調(diào)整其菌液濃
度,制成合于檢定用的平板。
4.4.3.2　標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
　　可參照SN 0179?92中的6.1。
4.4.3.3　檢測
　　每個樣品用三個檢定平板,在每個平板上,如不需定量時,置4 只消毒的牛津杯,對
角2只注滿樣液,剩余的2只杯里分別注滿0.6IU/mL和0.15 IU/mL杯菌肽標(biāo)準(zhǔn)工作液;如需
定量時,須置6只消毒的牛津杯,間隔注滿樣液和0.1 IU/mL桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)工作液,于36±1℃
培養(yǎng)17±1 h。
4.5　結(jié)果計算和表述
4.5.1　結(jié)果計算和表述
　　在三個檢定平板上,如樣液呈出與0.6IU/mL和0.15IU/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液相同的清晰抑
菌圈時,可用游標(biāo)卡尺或測量儀進行測量,其抑菌圈平均直徑在10 mm以上者為陽性。
　　對于需定量的實驗結(jié)果,將分別算出三個檢定平板上0.1 IU/mL和樣液的抑菌圈直徑
的平均值,經(jīng)校正后,于標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其抑菌圈直徑的平均值所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)濃度值,通
過式(1)計算可得出樣品中抗生素的含量:
c
X＝── ......................(1)
m
式中：X??樣品中桿菌肽的含量,IU/g;
　　　c??從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣液所對應(yīng)的抗生素濃度,IU/mL;
　　　m??zui終試液所代表的禽肉試樣的濃度,g/mL。
4.5.2　結(jié)果換算
　　如果樣品中桿菌肽含量的單位要采用mg/kg表示時,可將IU/g按照下述方法進行換算:
標(biāo)準(zhǔn)品中桿菌肽含量＝A IU/mg
　　樣品中桿菌肽含量＝B IU/g
1 IU＝1/A mg＝1/A×10＊＊3μg .............................(2)

B IU/g＝B/A×10＊＊3μg/g＝B/A×10＊＊3mg/kg .................(3)

式中：A??標(biāo)準(zhǔn)品中桿菌肽含量的數(shù)值;
　　　B??依據(jù)式(1)計算所得到的樣品中桿菌肽的數(shù)值。
5　測定低限、回收率
5.1　測定低限
　　本方法測定低限為0.025 IU/g。
5.2　回收率
　回收率的數(shù)據(jù):桿菌肽添加濃度在0.025～0.100IU/g范圍內(nèi),回收率為74.8％～108.8％。

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附　錄 A　
　　　　　　　　　　　　　 培養(yǎng)基成分及制備方法
　　　　　　　　　　　　　　　　 (補充件)
A1 增菌用培養(yǎng)基
　　　　蛋白胨 10.0g
　　　　牛肉浸膏　　　　　　　 5.0g
　　　　氯化鈉　　　　　　　　 2.5g
　　　　蒸餾水 1000mL
　　將上述各成分于蒸餾水中加熱溶解,用1 mol/L氫氧化鈉溶液或10％鹽酸調(diào)節(jié)pH,使
其滅菌后pH為7.0±0.1, 分裝于小試管中,每管約3mL,于121℃15min高壓滅菌。
A2　基層用培養(yǎng)基
　　　　蛋白胨　　　　　　　　 6.0g
　　　　牛肉浸膏　　　　　　　　 1.5g
　　　　酵母浸膏　　　　　　　 3.0g
　　　　瓊脂 15.0g
　　　　蒸餾水 1000mL
　　將上述各成分于蒸餾水中加熱溶解,用1mol/L氫氧化鈉溶液或10％鹽酸調(diào)節(jié)pH,使其
滅菌后pH為6.5±0.1,分裝于錐形瓶內(nèi),于121℃15 min高壓滅菌,備用。
A3　菌種層用培養(yǎng)基
　　　　蛋白胨　　　　　　　　 6.0g
　　　　牛肉浸膏　　　　　　　 1.5g
　　　　酵母浸膏　　　　　　　 3.0g
　　　　葡萄糖　　　　　　　　 1.0g
　　　　胰酪蛋白　　　　　　　 4.0g
　　　　瓊脂 15.0g
　　　　蒸餾水 1000mL
　　將上述各成分于蒸餾水中加熱溶解,用1mol/L氫氧化鈉溶液或10％鹽酸調(diào)節(jié)pH,使其
滅菌后pH為6.5±0.1,分裝于錐形瓶和大試管內(nèi),于121℃15min高壓滅菌。滅菌后將試管
制備成所需斜面?zhèn)溆谩?br />附 錄 B
檢驗程序圖
(補充件)
試樣(10.0g)　　　　　　　　　　　標(biāo)準(zhǔn)貯備液　　　　　　　　　　　試驗菌培養(yǎng)
┃　　　　　　　　　　　　　　　┃　　　　　　　　　　　　　　　┃
┃ 于均質(zhì)杯內(nèi)加入 ┃ ┃
┃ 17 mL33％吡啶 ┃ ┃
┃ ┃ ┃
均質(zhì)3min ┃ ┃
┃ 移入離心管 ┃ ┃
┃ ┃ ┃
離心20min(3000r/min) 標(biāo)準(zhǔn)工作液　　　　　　　　　　　菌液制備
┃　　　　　　　　　　　　　　　┃ ┃
取上清液(10mL) ┃ ┃
┃ ┃ ┃
┃ 加入30mL甲醇 ┣━━━━━━━━━━━━檢定用平板制備
┃ ┃　　　　　　　　　　　　　　　┃
振搖2min ┃ ┃
┃ ┃ ┃
離心20min 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線 ┃
┃ ┃
取上清液入茄形瓶 ┃
┃ ┃
蒸 干 ┃
┃ 加入3 mL 5％ ┃
┃　磷酸鹽緩沖液 ┃
┃ ┃
樣液(pH6.5) ┃
┃ ┃
┗━━━━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━┛
┃
檢 測
　　　　　　　　　　　　　　　　　 ┃
結(jié)果計算和表述

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附加說明:
本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國國家進出口商品檢驗局提出。
本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國天津進出口商品檢驗局負(fù)責(zé)起草。
本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人袁而森、王素琴、李劍影。
本標(biāo)準(zhǔn)等同采用日本厚生省檢驗方法,畜水產(chǎn)食品中の殘留物質(zhì)檢查法(1990)。
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中華人民共和國國家進出口商品檢驗局1993-12-28批準(zhǔn) 1994-05-01實施